Agencia Estatal Boletín Oficial del Estado

LAS ORDENES DE ESTE DEPARTAMENTO DE 14 DE AGOSTO DE 1967, DE 22 DE MARZO DE 1971 Y DE 30 DE SEPTIEMBRE DE 1981, ESTABLECEN, CONFORME AL REGLAMENTO DE CENTRALES LECHERAS Y OTRAS INDUSTRIAS LACTEAS, UN SISTEMA DE PAGO DE LA LECHE POR SU CALIDAD, SI BIEN PRESCINDEN DE LAS CARACTERISTICAS HIGIENICAS DEL PRODUCTO Y ATIENDEN A SU COMPOSICION.

EL REAL DECRETO 492/1985, DE 20 DE MARZO, SOBRE REGULACION DE LA CAMPAÑA LECHERA 1985-1986, ORDENA, EN SU ARTICULO QUINTO, QUE SE ESTABLEZCA UN NUEVO SISTEMA DE PAGO DE LA LECHE POR LA CALIDAD.

LA EXPERIENCIA ADQUIRIDA CON LA APLICACION DEL SISTEMA DE PAGO POR CALIDAD VIGENTE Y CON MOTIVO DE LAS NORMAS DE REGULACION DE LAS CORRESPONDIENTES CAMPAÑAS LECHERAS, ACONSEJA MODIFICAR ALGUNOS DE LOS PARAMETROS UTILIZADOS CON ESTE FIN E INCLUIR LA CALIDAD HIGIENICA DEL PRODUCTO.

EN CONSECUENCIA, ESTE MINISTERIO DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION, ESTABLECIDAS LAS CONSULTAS CON LOS SECTORES INTERESADOS, HA TENIDO A BIEN DISPONER LO SIGUIENTE:

PRIMERO.-EL PAGO DE LA LECHE A LOS GANADEROS SE HARA EN FUNCION DE SU COMPOSICION Y SU CALIDAD HIGIENICA.

EL SISTEMA DE PAGO POR CALIDAD, CONFORME A SU COMPOSICION, SERA OBLIGATORIO, Y POR CALIDAD HIGIENICA, TENDRA CARACTER VOLUNTARIO POR LOS SECTORES GANADERO E INDUSTRIAL.

SEGUNDO.-LOS PARAMETROS PARA VALORAR LA COMPOSICION DE LA LECHE SERAN LA MATERIA GRASA Y LA PROTEINA Y PARA LA APRECIACION DE LA CALIDAD HIGIENICA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS MESOFILOS AEROBIOS VIABLES.

TERCERO.-LOS GRUPOS DE GANADEROS, FORMALMENTE CONSTITUIDOS, Y QUE LO SOLICITEN, SERAN CONSIDERADOS, A EFECTOS DEL PAGO DE CALIDAD, COMO PROVEEDOR UNICO DEL CONJUNTO DE LA LECHE APORTADA POR SUS ASOCIADOS, SEA CUAL FUERE EL LUGAR DE ENTREGA, SIEMPRE Y CUANDO ESTA NO SE EFECTUE INDEPENDIENTEMENTE POR CADA UNO O PARTE DE SUS COMPONENTES Y QUE APAREZCA ANTE LA INDUSTRIA UN SOLO RESPONSABLE DEL GRUPO, QUIEN SERA EL UNICO CAPACITADO PARA PERCIBIR LAS LIQUIDACIONES POR EL TOTAL DE LA LECHE ENTREGADA.

CUARTO.-EL NUMERO MINIMO DE ANALISIS MENSUALES POR GANADERO O GRUPO DE GANADEROS SERA DE DOS, EFECTUANDOSE LOS ANALISIS EN LOS DIAS QUE SE ESTIMEN OPORTUNOS.

EN EL SUPUESTO DE QUE LOS GANADEROS EFECTUARAN DOS ENTREGAS DIARIAS, EL NUMERO MINIMO DE ANALISIS A REALIZAR SERIA DE CUATRO, CORRESPONDIENDO DOS A LA ENTREGA DE LA MAÑANA, Y OTROS DOS A LA DE LA TARDE, OBTENIENDOSE EN TODO CASO EL PORCENTAJE MEDIO PONDERADO MENSUAL DE LOS RESULTADOS DE LOS ANALISIS.

QUINTO.-A LOS EFECTOS DEL PAGO DE LECHE POR CALIDAD, SE ADOPTAN, COMO TECNICAS, LAS SIGUIENTES:

LAS TOMAS DE MUESTRAS DE LECHE SERAN EFECTUADAS EN LAS CONDICIONES DEFINIDAS EN EL ANEJO 1 DE LA PRESENTE ORDEN (UNE 34-828-83, ANEXO A).

LA DETERMINACION DE LA MATERIA GRASA SE REALIZARA POR EL METODO OFICIAL (GERBER, ANEXO III, 1 (E), DE LA ORDEN DE 31 DE ENERO DE 1977) Y LA CORRESPONDIENTE A PROTEINAS, POR EL PROCEDIMIENTO DE NEGROAMIDO (UNE 34-835-85, ANEJO 2 ADJUNTO).

LA ESTIMACION DE LA CALIDAD HIGIENICA SE VERIFICARA POR EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS A 30.C (UNE 34-805-83) (ANEJO 3 DE ESTA DISPOSICION).

PARA LA DETERMINACION DEL EXTRACTO SECO MAGRO, SE RESTARA DEL EXTRACTO SECO TOTAL, OBTENIENDO SEGUN EL METODO OFICIAL, DESCRITO EN EL ANEXO III, 5 (A), DE LA ORDEN DE 31 DE ENERO DE 1977, LA MATERIA GRASA DETERMINADA POR EL METODO DE GERBER.

LA ACIDEZ SE VALORARA CONFORME AL METODO OFICIAL SEÑALADO EN EL ANEXO II, 8 (A), DE LA ULTIMA DISPOSICION MENCIONADA.

SEXTO.-PARA LA DETERMINACION DE GRASAS, PROTEINAS, EXTRACTOS SECOS Y RECUENTOS MICROBIANOS EN LA LECHE, PODRAN UTILIZARSE ASIMISMO LOS EQUIPOS ANALIZADORES AUTOMATICOS QUE FIGURAN EN EL ANEJO 4, CUYA CONTRASTACION REALIZARA EL MINISTERIO DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION, EN LOS LABORATORIOS DE LAS INDUSTRIAS LACTEAS, ADOPTANDOSE COMO METODOS DE REFERENCIA PARA TAL CONTRASTACION LOS SIGUIENTES: GRASA, ROSE-GOTTLIEB; PROTEINAS, KJELDAHL; EXTRACTO SECO, GRAVIMETRIA (EPIGRAFE 1 (A), 2 Y 5/A), RESPECTIVAMENTE, DEL ANEXO III DE LA ORDEN DE 31 DE ENERO DE 1977) Y CALIDAD HIGIENICA, RECUENTO DE MICROORGANISMOS (UNE 34-805-83).

LA CONSTRASTACION DE EQUIPOS ANALIZADORES AUTOMATICOS QUE NO FIGUREN EN EL ANEJO 4 DEBERA SOLICITARSE DEL MINISTERIO DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION. LA PETICION DE CONTRASTACION, QUE SERA RESUELTA POR EL CITADO MINISTERIO DE AGRICULTURA, DEBERA HACER CONSTAR, RESPECTO A CADA EQUIPO INSTRUMENTAL, SUS ESPECIFICACIONES TECNICAS, Y ENTRE ELLAS: CLASE DE MEDIDA, CAPACIDAD POR UNIDAD DE TIEMPO, MARGEN DE LAS MEDICIONES, PRECISION (DESVIACION TIPICA RESPECTO AL CORRESPONDIENTE METODO DE REFERENCIA), REPETIBILIDAD (DESVIACION TIPICA ENTRE PRUEBAS DUPLICADAS) Y REFERENCIAS, EN SU CASO, DE INSTITUCIONES, OFICIALES Y PRIVADAS, QUE HAYAN APROBADO EL EQUIPO ANALIZADOR.

SEPTIMO.-LAS LECHES SE DISTRIBUIRAN, CONFORME A SU CALIDAD HIGIENICA, EN LAS CLASES SIGUIENTES:

CLASE 1. HASTA 200.000 BACTERIAS POR MILILITRO;

CLASE 2. DE 200.001 A 700.000 BACTERIAS POR MILILITRO;

CLASE 3. DE 700.001 A 2.000.000 DE BACTERIAS POR MILILITRO;

CLASE 4. MAS DE 2.000.000 DE BACTERIAS POR MILILITRO;

OCTAVO.-LOS LABORATORIOS INTERPROFESIONALES SERAN LOS ENCARGADOS DE EFECTUAR LAS TOMAS DE MUESTRAS Y LOS ANALISIS QUIMICOS Y MICROBIOLOGICOS Y, DONDE NO FUNCIONEN AQUELLOS, LOS LABORATORIOS DE LAS INDUSTRIAS LACTEAS.

NOVENO.-TODOS LOS LABORATORIOS, EXCEPTO LOS INTERPROFESIONALES, ESTARAN OBLIGADOS A ELABORAR UN REGISTRO DE LOS ANALISIS REALIZADOS, A LOS FINES DEL PAGO POR CALIDAD, QUE ESTARA EN TODO MOMENTO A DISPOSICION DE LOS SERVICIOS COMPETENTES DEL MINISTERIO DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION Y DE LAS COMUNIDADES AUTONOMAS, A CUYOS SERVICIOS OFICIALES PODRAN RECURRIR LOS GANADEROS EN LOS CASOS DE DISCONFORMIDAD.

DECIMO.-LOS GANADEROS PODRAN DESIGNAR TECNICO O TECNICOS A SU SERVICIO, QUIENES DEBERAN COMPROBAR Y DAR SU CONFORMIDAD POR ESCRITO, A LAS TOMAS DE MUESTRAS Y RESULTADOS DE LOS ANALISIS QUE SE REALICEN EN LOS LABORATORIOS DE LAS INDUSTRIAS LACTEAS.

UNDECIMO.-LAS PRIMAS TENDRAN CARACTER GENERAL PARA TODA ESPAÑA Y SE APLICARAN EXCLUSIVAMENTE A LA LECHE, COMO PRODUCTO INTEGRO, NO ALTERADO NI ADULTERADO Y SIN CALOSTRO, PROCEDENTE DEL ORDEÑO HIGIENICO, REGULAR, COMPLETO E ININTERRUMPIDO, DE LAS VACAS SANAS Y BIEN ALIMENTADAS, QUE CUMPLAN LOS REQUISITOS SIGUIENTES:

GRASA, MINIMO, 3,2 POR 100 (M/M).

PROTEINAS, MINIMO, 3 POR 100 (M/M).

EXTRACTO SECO MAGRO, MINIMO, 8,2 POR 100 (M/M).

ACIDEZ, MAXIMO, 18.D.

DUODECIMO.-SE DEBERAN INVESTIGAR POR LOS LABORATORIOS LA POSIBLE ADICION DE AGUA A LA LECHE QUE ENTREGUEN LOS GANADEROS, Y SERA OBLIGATORIA TAL INVESTIGACION EN TODAS LAS MUESTRAS, QUE TENGAN MENOS DEL 2,5 POR 100 DE PROTEINAS.

EL REGISTRO DE LOS ANALISIS QUE MOTIVEN TAL INVESTIGACION ESTARA A DISPOSICION DE LOS SERVICIOS COMPETENTES DEL MINISTERIO DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION Y COMUNIDADES AUTONOMAS.

DECIMOTERCERO.-LAS PRIMAS Y DESCUENTOS, EN FUNCION DE LA COMPOSICION Y CALIDAD HIGIENICA DE LAS LECHES ENTREGADAS POR LOS GANADEROS, SE AJUSTARA A LA SISTEMATICA SIGUIENTE:

A) POR EL CONTENIDO EN GRASA:

PRIMAS: 0,50 PESETAS/LITRO POR CADA DECIMA DE GRASA QUE SOBREPASE EL PORCENTAJE MINIMO SEÑALADO DEL 3,2 POR 100.

DESCUENTOS: 0,50 PESETAS/LITRO POR CADA DECIMA DE GRASA QUE DESCIENDA DEL PORCENTAJE MINIMO SEÑALADO DEL 3,2 POR 100.

B) POR EL CONTENIDO EN PROTEINAS:

PRIMAS: 0,25 PESETAS/LITRO POR CADA DECIMA DE PROTEINAS QUE EXCEDA DEL 3 POR 100.

DESCUENTOS: 0,25 PESETAS/LITRO POR CADA DECIMA DE PROTEINAS QUE DESCIENDA DEL PORCENTAJE MINIMO SEÑALADO DEL 3 POR 100.

C) POR LA CALIDAD HIGIENICA:

LAS PRIMAS POR CALIDAD HIGIENCIA SON INDEPENDIENTES DE LAS QUE VOLUNTARIAMENTE TIENEN ESTABLECIDAS LAS INDUSTRIAS CON LOS GANADEROS, POR APLICACION DEL FRIO EN PRODUCCION, Y TALES PRIMAS Y DESCUENTOS SERAN APLICABLES SOLO A LA LECHES REFRIGERADAS, EN LA FORMA SIGUIENTE:

PRIMAS: 2 PESETAS/LITRO EN LAS LECHES DE CLASE 1. Y 1 PESETA/LITRO EN LAS LECHES DE CLASE 2.

DESCUENTOS: 0,25 PESETAS/LITRO POR CADA MILLON DE BACTERIAS QUE PASE DE 2.000.000 DE BACTERIAS POR ML. LA POBLACION DE BACTERIAS SE REDONDEARA A UN NUMERO ENTERO DE MILLONES, POR EXCESO, CUANDO SE TRATE DE UNA FRACCION SUPERIOR A MEDIO MILLON, Y POR DEFECTO, EN CASO CONTRARIO.

DECIMOCUARTO.-A LA ENTRADA EN VIGOR DE ESTA DISPOSICION, QUEDARAN DEROGADAS LAS ORDENES DEL MINISTERIO DE AGRICULTURA DE 14 DE AGOSTO DE 1967, 22 DE MARZO DE 1971 Y 30 DE SEPTIEMBRE DE 1981.

DECIMOQUINTO.-LA PRESENTE ORDEN ENTRARA EN VIGOR EL DIA 1 DE SEPTIEMBRE DE 1985, Y

DECIMOSEXTO.-SE FACULTA A LA DIRECCION GENERAL DE POLITICA ALIMENTARIA PARA QUE DICTE LAS NORMAS QUE DESARROLLEN EL CONTENIDO DE ESTA DISPOSICION.

MADRID, 27 DE JUNIO DE 1985.-ROMERO HERRERA.

ANEJO I

METODOS DE RUTINA PARA EL MUESTREO DE LECHE PARA EL PAGO EN FUNCION DE LA CALIDAD

ANEXO A DE LA NORMA ESPAÑOLA UNE 34-828-83

A.1 AMBITO DE APLICACION

EL PRESENTE ANEXO TRATA DEL MUESTREO DE LA LECHE CRUDA PARA EL PAGO DE LOS PRODUCTOS EN FUNCION DE SU CALIDAD: CALIDAD HIGIENICA (POR EJEMPLO, ANALISIS SENSORIAL, CALIDAD MICROBIOLOGICA, RECUENTO DE CELULAS SOMATICAS, SEDIMENTO) Y COMPOSICION (POR EJEMPLO, MATERIA GRASA, PROTEINAS, ADICION DE AGUA).

A.2 GENERALIDADES

EL MUESTREO DEBE EFECTUARSE POR UN OPERARIO CUALIFICADO, QUE HAYA RECIBIDO UN MINIMO DE FORMACION ANTES DE PROCEDER AL MUESTREO DE PARTIDAS DE LECHE. EN CASO DE UTILIZACION DE MATERIAL DE MUESTREO AUTOMATICO O SEMIAUTOMATICO, ESTE MATERIAL DEBERA SUFRIR, ANTES DE SER UTILIZADO EN LA PRACTICA Y A INTERVALOS REGULARES, UN PERIODO DE ENSAYOS ADECUADOS, DE ACUERDO CON LAS AUTORIDADES RESPONSABLES.

CUANDO SE TOMAN SIMULTANEAMENTE VARIAS MUESTRAS PARA DIFERENTES ANALISIS, LA DESTINADA A ANALISIS MICROBIOLOGICOS SE TOMARA EN PRIMER LUGAR. EL CODIGO DE IDENTIFICACION DE LOS RECIPIENTES PARA MUESTRAS, EL VOLUMEN Y EL TIPO DE RECIPIENTES, ASI COMO LAS CONDICIONES DE CONSERVACION Y DE ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS DEBERAN ESTAR CONFORMES CON LAS PRESCRIPCIONES REGLAMENTARIAS O CON LAS ESPECIFICACIONES IMPUESTAS POR EL LABORATORIO DE ANALISIS.

A.3 MATERIAL DE MUESTREO

CARACTERISTICAS.-LA TOTALIDAD DEL MATERIAL DE MUESTREO SERA DE ACERO INOXIDABLE O DE CUALQUIER MATERIAL APROPIADO, SUFICIENTEMENTE SOLIDO Y RESISTENTE, Y QUE NO APORTEN A LA MUESTRA MODIFICACIONES SUSCEPTIBLES DE AFECTAR POSTERIORMENTE A LOS RESULTADOS DEL ANALISIS. EL MATERIAL SERA SUFICIENTEMENTE ROBUSTO PARA PREVENIR CUALQUIER DEFORMACION CON EL USO. SERA, SIN EMBARGO, SUFICIENTEMENTE LIGERO PARA QUE EL OPERARIO PUEDA DESPLAZARLO CON RAPIDEZ A TRAVES DEL PRODUCTO. LAS SOLDADURAS QUE EVENTUALMENTE ENTREN EN LA FABRICACION DEL MATERIAL DEBERAN PODER SOPORTAR UNA ESTERILIZACION A 180. C. TODAS LAS SUPERFICIES ESTARAN LISAS Y EXENTAS DE HENDIDURAS Y LOS ANGULOS ESTARAN PULIDOS.

EL MATERIAL DE MUESTREO ESTARA DE ACUERDO CON LAS PRESCRIPCIONES PREVISTAS PARA CADA TIPO DE PRODUCTOS A MUESTREAR.

MUESTREOS DESTINADOS A ANALISIS MICROBIOLOGICO.-EL MATERIAL DE MUESTREO DEBERA ESTAR PERFECTAMENTE LIMPIO Y ESTERILIZADO. SI ES POSIBLE, LA ESTERILIZACION DEBERA EFECTUARSE SEGUN UNO DE LOS METODOS SIGUIENTES:

A) PERMANENCIA DE DOS HORAS EN AIRE CALIENTE A 160. C COMO MINIMO.

B) PERMANENCIA DE QUINCE A VEINTE MINUTOS EN VAPOR DE AGUA A 120.C (AUTOCLAVE). EL MATERIAL DEBERA ESTAR SECO ANTES DE SU EMPLEO.

DESPUES DE LA ESTERILIZACION POR CUALQUIERA DE LOS DOS METODOS, EL MATERIAL PODRA UTILIZARSE CON POSTERIORIDAD, SI SE CONSERVA EN CONDICIONES ESTERILES.

CUANDO EN UNA SITUACION PARTICULAR LA ESTERILIZACION POR LOS METODOS A) O B) RESULTE IMPOSIBLE, SE PODRA RECURRIR A OTROS METODOS, QUE SE CITAN A CONTINUACION, CONSIDERADOS COMO METODOS SECUNDARIOS, A CONDICION DE UTILIZAR EL MATERIAL DE MUESTREO INMEDIATAMENTE DESPUES DE LA ESTERILIZACION.

C) PERMANENCIA DE UNA HORA EN VAPOR SATURADO DE 100. C. LA CONDENSACION DEL VAPOR DEBERA ESTAR A UNA TEMPERATURA DE 98. C COMO MINIMO.

D) INMERSION DURANTE UN MINUTO AL MENOS EN AGUA HIRVIENDO.

E) INMERSION EN ALCOHOL ETILICO DEL 70 POR 100 (V/V) Y FLAMEADO PARA ELIMINAR EL ALCOHOL POR COMBUSTION.

F) EXPOSICION A UNA LLAMA APROPIADA, CUIDANDO QUE TODAS LAS SUPERFICIES UTILES DEL MATERIAL ESTEN EN CONTACTO CON LA LLAMA.

MUESTREO DESTINADO A ANALISIS QUIMICO Y/O FISICO.-ES DESEABLE DISPONER DE MATERIAL ESTERIL; EN CUALQUIER CASO, EL MATERIAL ESTARA LIMPIO Y SECO Y NO PODRA INFLUIR EN LAS PROPIEDADES NI EN LA COMPOSICION DEL PRODUCTO.

MUESTREO DESTINADO A ANALISIS SENSORIAL.-ES DESEABLE DISPONER DE MATERIAL ESTERIL; EN CUALQUIER CASO, EL MATERIAL ESTARA LIMPIO Y SECO Y NO PODRA INFLUIR EN EL OLOR NI EN EL SABOR DEL PRODUCTO.

A.3.1. AGITADORES.

LOS AGITADORES PARA LA MEZCLA DE LIQUIDOS A GRANEL DEBEN TENER UNA SUPERFICIE SUFICIENTE PARA REMOVER DEBIDAMENTE EL PRODUCTO SIN QUE APAREZCA UN OLOR RANCIO. DADAS LAS DIVERSAS FORMAS Y DIMENSIONES DE LOS RECIPIENTES, NO ES POSIBLE RECOMENDAR UN TIPO PARTICULAR DE AGITADOR UTILIZABLE EN TODAS LAS CIRCUNSTANCIAS, PERO DEBERA ESTAR DISEÑADO DE MANERA QUE NO ARAÑE EL INTERIOR DE LOS RECIPIENTES DURANTE LA AGITACION.

SE PUEDE RECOMENDAR UN TIPO DE AGITADOR QUE SE ADAPTE A LA MEZCLA DE LIQUIDOS EN CUBOS O BIDONES, QUE TENGA APROXIMADAMENTE LAS DIMENSIONES SIGUIENTES (VER FIGURA 1): UN DISCO DE 150 MILIMETROS DE DIAMETRO, PERFORADO POR SEIS ORIFICIOS DE 12,5 MILIMETROS DE DIAMETRO, DISPUESTOS SOBRE UNA CIRCUNFERENCIA DE 100 MILIMETROS DE DIAMETRO, Y EN SU CENTRO SE FIJA UNA VARILLA METALICA, EN CUYO EXTREMO OPUESTO POSEE UNA EMPUÑADURA. LA LONGITUD DE LA VARILLA, INCLUIDA LA EMPUÑADURA, ES DE APROXIMADAMENTE UN METRO.

UN AGITADOR CONVENIENTE PARA LOS CAMIONES-CISTERNA, VAGONESCISTERNA Y CISTERNAS INSTALADAS EN GRANJA, TENDRA EL ASPECTO Y LAS DIMENSIONES APROXIMADAS QUE SE INDICAN A CONTINUACION (VER FIGURA 2): UNA VARILLA DE DOS METROS, COMO MINIMO, PROVISTA DE UN DISCO DE 300 MILIMETROS DE DIAMETRO, PERFORADO POR 12 AGUJEROS DE 30 MILIMETROS DE DIAMETRO, DISPUESTOS SOBRE UNA CIRCUNFERENCIA DE 230 MILIMETROS DE DIAMETRO .

(FIGURAS OMITIDAS)

PARA MEZCLAR EL CONTENIDO DE GRANDES RECIPIENTES SE RECURRIRA A UNA AGITACION MECANICA MEDIANTE AIRE COMPRIMIDO LIMPIO. SE UTILIZARA UNA PRESION ATMOSFERICA Y UN VOLUMEN DE AIRE MINIMOS PARA EVITAR EL DESARROLLO DE OLOR RANCIO.

NOTA: CUANDO EN LA PRESENTE GUIA SE PREVEA LA UTILIZACION DE AIRE COMPRIMIDO LIMPIO, SE TRATARA OBLIGATORIAMENTE DE AIRE COMPRIMIDO EN LOS QUE TODOS LOS CONTAMINANTES (COMPRENDIDO EL ACEITE, AGUA Y POLVO) HAN SIDO ELIMINADOS. NO DEBERA EXCLUIRSE LA POSIBILIDAD DE UNA CONTAMINACION MICROBIOLOGICA.

A.3.2 MEZCLADORES POR INMERSION O EXTRACTORES.

CACILLOS.-EN LA FIGURA 3 SE REPRODUCE UN CACILLO DE FORMA Y DIMENSIONES CONVENIENTES PARA LA TOMA DE MUESTRAS. ESTA PROVISTO DE MANGO RESISTENTE DE UNA LONGITUD DE 150 MILIMETROS COMO MINIMO. LA CAPACIDAD DEL CACILLO NO PODRA SER INFERIOR A 50 MILILITROS. EL MANGO CURVADO FACILITARA SU UTILIZACION. LA FORMA CONICA DE LOS CACILLOS PERMITE ENCAJARLOS UNOS DENTRO DE OTROS.

PARA EL MUESTREO PROPORCIONAL DE MUESTRAS CONTENIDAS EN MAS DE UN RECIPIENTE SE PUEDE UTILIZAR UN CACILLO DE LA MISMA CAPACIDAD, PERO CUYAS PAREDES SEAN PARALELAS Y ESTEN DIVIDIDAS EN CINCO PARTES IGUALES.

CILINDROS DE EXTRACCION DE MUESTRAS.-EL EXTRACTOR DE MUESTRAS (FIGURA 4) SE COMPONE DE DOS TUBOS CONCENTRICOS PERFECTAMENTE AJUSTADOS, DE LOS QUE UNO GIRA DENTRO DEL OTRO Y SE ACCIONA MEDIANTE UN MANDO ALOJADO EN LA CABEZA DEL CILINDRO, QUE TIENE UN GIRO DE 90. A LO LARGO DE LOS DOS TUBOS CONCENTRICOS, COLOCADOS EN OPOSICION, SE PRACTICAN ABERTURAS DE 50 MILIMETROS DE LARGO Y 6 MILIMETROS DE ANCHO, SEPARADAS POR UN ESPACIO DE 20 MILIMETROS.

CUANDO EL TUBO INTERIOR SE GIRA HACIA UNA DE LAS EXTREMIDADES, LAS ABERTURAS DE LOS DOS TUBOS COINCIDEN, COLOCANDOSE EN POSICION ABIERTA, PERMITIENDO AL LIQUIDO ENTRAR EN EL CILINDRO. CUANDO LA CABEZA SE GIRA HACIA EL LADO OPUESTO, LAS ABERTURAS DEJAN DE COINCIDIR Y EL CILINDRO QUEDA CERRADO. LAS EXTREMIDADES, SUPERIOR E INFERIOR, DEL CILINDRO ESTAN PROVISTAS DE CAPSULAS ROSCADAS PARA FACILITAR LA LIMPIEZA. LA LONGITUD DEL APARATO VARIA CON LA PROFUNDIDAD DE LOS RECIPIENTES EN LOS QUE SE UTILIZARA EL CILINDRO, PERO GENERALMENTE ES SUFICIENTE CON UNA LONGITUD DE UN METRO.

A.4 RECIPIENTES DE MUESTRAS

CARACTERISTICAS.-LOS RECIPIENTES PARA MUESTRAS, ASI COMO LOS DISPOSITIVOS DE CIERRE, DEBEN ESTAR FABRICADOS CON MATERIALES ADECUADOS Y CONCEBIDOS PARA PROTEGER LA MUESTRA SIN CAUSAR MODIFICACION DE ESTA, QUE SEA SUSCEPTIBLE DE INFLUIR EN LOS RESULTADOS DE LOS ANALISIS O EXAMENES POSTERIORES. LOS MATERIALES APROPIADOS SON EL VIDRIO, CIERTOS METALES Y ALGUNAS MATERIAS PLASTICAS. ES PREFERIBLE QUE EL RECIPIENTE ELEGIDO SEA OPACO. SI ES TRANSPARENTE, EL RECIPIENTE Y SU CONTENIDO SERAN CONSERVADOS AL ABRIGO DE LA LUZ.

LOS RECIPIENTES Y DISPOSITIVOS DE CIERRE ESTARAN LIMPIOS Y SECOS, SERAN ESTERILES Y SUSCEPTIBLES DE SER ESTIRILIZADOS, SEGUN UNO DE LOS METODOS DESCRITOS EN EL APARTADO A.3. LA FORMA Y LA CAPACIDAD DEL RECIPIENTE DEBERAN RESPONDER A LAS PRESCRIPCIONES PREVISTAS PARA EL PRODUCTO A MUESTREAR.

PODRAN UTILIZARSE RECIPIENTES NO REUTILIZABLES, EN MATERIA PLASTICA, ASI COMO HOJAS DE ALUMINIO (ESTERILES O NO) Y SACOS O BOLSAS ADECUADOS DE MATERIA PLASTICA, PROVISTOS DE SISTEMA APROPIADO DE CIERRE.

LOS RECIPIENTES DISTINTOS DE LOS SACOS O BOLSAS DE MATERIA PLASTICA SE CERRARAN HERMETICAMENTE MEDIANTE UN TAPON APROPIADO, UNA CAPSULA ROSCADA, METALICA O DE PLASTICO, PROVISTA INTERIORMENTE, SI ES NECESARIO, DE UNA JUNTA DE ESTANQUIDAD DE PLASTICO INSOLUBLE, NO ABSORBENTE, IMPERMEABLE A LAS GRASAS Y QUE NO ALTERE EL OLOR, SABOR, LAS PROPIEDADES O LA COMPOSICION DE LA MUESTRA. LOS TAPONES ESTARAN FABRICADOS O RECUBIERTOS DE UNA MATERIA INODORA Y NO ABSORBENTE. LOS RECIPIENTES PARA PRODUCTOS SOLIDOS, PASTOSOS O VISCOSOS SERAN DE BOCA ANCHA.

LOS PEQUEÑOS RECIPIENTES PARA LA VENTA AL DETALLE SE UTILIZARAN IGUALMENTE COMO RECIPIENTES DE MUESTREO; LA MUESTRA CONSTITUIRA EL CONTENIDO DE UNO O VARIOS DE ESTOS RECIPIENTES INTACTOS Y NO ABIERTOS.

DEBERAN RESPONDER A LAS ESPECIFICACIONES IMPUESTAS POR EL LABORATORIO DE ANALISIS. LOS RECIPIENTES PARA MUESTRAS TENDRAN UNA CAPACIDAD SUFICIENTE PARA QUE LA MUESTRA LOS LLENE PRACTICAMENTE Y PERMITAN UNA BUENA MEZCLA DEL CONTENIDO ANTES DEL ANALISIS, EVITANDO EL BATIDO DURANTE EL TRANSPORTE.

A.5 TECNICA DE MUESTREO

A.5.1 GENERALIDADES.

CUALQUIERA QUE SEA EL ANALISIS EFECTUADO (PRINCIPALMENTE EN LO CONCERNIENTE A ANALISIS MICROBIOLOGICO, DETERMINACION DE MATERIA GRASA Y EXTRACTO SECO Y RECUENTO DE CELULAS SOMATICAS), LA LECHE SE MEZCLARA CUIDADOSAMENTE, CON EL FIN DE GARANTIZAR UNA MUESTRA REPRESENTATIVA DEL CONJUNTO DEL LOTE. EL GRADO DE AGITACION ESTARA EN FUNCION:

A) DEL VOLUMEN DE LA LECHE.

B) DE LA FORMA Y DIMENSIONES DEL RECIPIENTE.

C) DE LA TEMPERATURA DE LA LECHE.

D) DEL TIEMPO DURANTE EL QUE SE HA DEJADO REPOSAR LA LECHE.

E) DEL METODO DEL MUESTREO (MANUAL, AUTOMATICO O SEMIAUTOMATICO).

LA MEZCLA DE LA LECHE CRUDA EN UN RECIPIENTE SE CONSIDERA COMO EFICAZ SI LA DIFERENCIA DE LOS CONTENIDOS DE MATERIA GRASA ENTRE DOS MUESTRAS ELEMENTALES TOMADAS EN LUGARES DIFERENTES DEL RECIPIENTE O A LA SALIDA, A DIFERENTES INTERVALOS DURANTE EL VACIADO, ES INFERIOR A 0,1 POR 100.

LA MUESTRA SE TOMARA INMEDIATAMENTE DESPUES DE LA MEZCLA, MIENTRAS QUE LA LECHE ESTE TODAVIA EN MOVIMIENTO Y EL VOLUMEN DE LA MUESTRA ESTARA CONFORME CON LAS INSTRUCCIONES PRESCRITAS POR EL LABORATORIO DE ANALISIS.

A.5.2 MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO.

LA DIMENSION DE LA MUESTRA ESTARA CONFORME A LAS INSTRUCCIONES DEL LABORATORIO DE ANALISIS.

A.5.2.1 LAS MUESTRAS DESTINADAS AL ANALISIS MICROBIOLOGICO SE TOMARAN EN PRIMER LUGAR.

A.5.2.2 EL MATERIAL DE MUESTREO Y LOS RECIPIENTES PARA MUESTRAS SE ESTERILIZARAN SEGUN LOS METODOS DESCRITOS EN EL APARTADO A.3.

IGUALMENTE, SE PODRA RECURRIR A LOS METODOS DE ESTERILIZACION SIGUIENTES:

A) INMERSION EN UNA SOLUCION RECIENTEMENTE PREPARADA DE HIPOCLORITO SODICO (200 MG DE CLORO ACTIVO/LITRO) O DE IODOFORO (40 O 50 MG DE IODO ACTIVO/LITRO), DURANTE CINCO MINUTOS COMO MINIMO, A LA TEMPERATURA AMBIENTE, SEGUIDO DE UN ESCURRIDO O DE SUPERFICIAL, POR EJEMPLO, SACUDIENDO. DESPUES DE LA INMERSION EN LA SOLUCION DE HIPOCLORITO Y ESCURRIDO EL MATERIAL, PODRA LAVARSE CUIDADOSAMENTE EN LA LECHA SOMETIDA A MUESTREO.

B) INMERSION, DURANTE TREINTA SEGUNDOS COMO MINIMO, EN AGUA, A UNA TEMPERATURA DE AL MENOS 85. C, Y ELIMINACION DEL AGUA SUPERFICIAL, POR EJEMPLO, SACUDIENDO.

IGUALMENTE SE PUEDE AUTORIZAR, PRINCIPALMENTE EN EL CASO DE EQUIPOS AUTOMATICOS O SEMIAUTOMATICOS, EL SIMPLE LAVADO DEL MATERIAL CON AGUA CORRIENTE ENTRE DOS MUESTREOS SUCESIVOS O EL LAVADO DEL MATERIAL CON LA LECHE SOMETIDA AL MUESTREO.

A.5.2.3 PROCEDER COMO DESCRIBE EL APARTADO A.5.

REFERENTE A LAS REGLAS DE ASEPSIA.

A.5.3 MUESTREO PARA LA DETERMINACION DE LA CALIDAD HIGIENICA (DISTINTA DE LA MICROBIOLOGIA) Y DE LA COMPOSICION.

LA DIMENSION DE LA MUESTRA ESTARA DE ACUERDO CON LAS INSTRUCCIONES DEL LABORATORIO DE ANALISIS.

A.5.3.1 MUESTREO MANUAL.

A.5.3.1.1 CANTARA.-INTRODUCIR CUIDADOSAMENTE UN AGITADOR EN LA LECHE EVITANDO QUE SE DERRAME FUERA DEL RECIPIENTE, DEJARLO CAER HASTA EL FONDO DEL RECIPIENTE Y RAPIDAMENTE HACERLO VOLVER A LA SUPERFICIE PARA CREAR UN MOVIMIENTO DE ROTACION DEL LIQUIDO DE ABAJO A ARRIBA. ESTE MOVIMIENTO ASCENDENTE Y DESCENDENTE DEBE SER SUFICIENTE PARA GARANTIZAR QUE LA LECHE ESTA CONVENIENTEMENTE MEZCLADA Y QUE LA NATA NO ESTA ADHERIDA EN EL CUELLO DE LA CANTARA.

A.5.3.1.2 RECIPIENTE DE MEDIDA.-ES INDISPENSABLE MEZCLAR CUIDADOSAMENTE LA LECHE EN EL RECIPIENTE SI SE QUIERE OBTENER UNA MUESTRA REPRESENTATIVA. UNA MEZCLA SE PRODUCE CUANDO SE VIERTE LA LECHE EN EL RECIPIENTE DE MEDIDA; LA IMPORTANCIA DE ESTA MEZCLA ESTARA EN FUNCION DE LA CONCEPCION DEL RECIPIENTE Y DE LA TECNICA DEL VERTIDO DE LA LECHE. ES INDISPENSABLE COMPLETAR ESTA ACCION POR UNA AGITACION MANUAL O MECANICA SUFICIENTE PARA ASEGURAR UN REPARTO UNIFORME DE LA MATERIA GRASA. LA EXPERIENCIA DETERMINARA LA IMPORTANCIA DE ESTA AGITACION SUPLEMENTARIA. LAS MUESTRAS SE TOMARAN, NORMALMENTE, EN EL RECIPIENTE DE MEDIDA. CUANDO EL VOLUMEN DE LA PARTIDA A MUESTREAR SOBREPASA LA CAPACIDAD DEL RECIPIENTE DE MEDIDA, SE TOMARA UNA MUESTRA REPRESENTATIVA DEL CONJUNTO DE LA PARTIDA PROCEDIENDO SEGUN EL METODO DESCRITO EN EL APARTADO A.5.3.1.4.

A.5.3.1.3 CISTERNAS PARA LA LECHE REFRIGERADAS.-LA LECHE SE AGITARA MECANICAMENTE HASTA QUE SE OBTENGA UNA HOMOGENEIDAD SUFICIENTE (DURANTE CINCO MINUTOS COMO MINIMO). SI LA CISTERNA ESTA PROVISTA DE UN SISTEMA PROGRAMADO DE AGITACION PERIODICA, EL MUESTREO NO EXIGE MAS QUE UNA CORTA AGITACION (UNO A DOS MINUTOS).

SI EL VOLUMEN DE LA LECHE REPRESENTA MENOS DEL 15 POR 100 DE LA CAPACIDAD DE LA CISTERNA, EL AGITADO SE EFECTUARA A MANO.

A.5.3.1.4 LA LECHE A GRANEL REPARTIDA EN VARIOS LOTES.-CUANDO LA LECHE A EXAMINAR SE ENCUENTRA EN MAS DE UN RECIPIENTE, SE TOMARA UNA CANTIDAD REPRESENTATIVA DE CADA RECIPIENTE, DESPUES DE HABER MEZCLADO SU CONTENIDO, Y SE ANOTARA LA CANTIDAD DE LECHE A LA QUE CORRESPONDE CADA MUESTRA.

SALVO QUE LAS MUESTRAS DE CADA RECIPIENTE SE SOMETAN A ENSAYOS SEPARADAMENTE, SE MEZCLARAN FRACCIONES DE ESTAS CANTIDADES REPRESENTATIVAS PROPORCIONALMENTE A LA CANTIDAD CONTENIDA EN EL RECIPIENTE DEL QUE SE HA TOMADO CADA MUESTRA. SE TOMARAN, UNA O MAS, MUESTRAS DE ESTAS CANTIDADES PROPORCIONALES DESPUES DE LA MEZCLA.

A.5.3.2 MUESTREO AUTOMATICO O SEMIAUTOMATICO.-CUANDO LA RECOGIDA DE LECHE SE EFECTUA MEDIANTE CAMION CISTERNA, SE UTILIZAN FRECUENTEMENTE MUESTREADORES AUTOMATICOS O SEMIAUTOMATICOS.

DEBE ASEGURARSE, POR UN LABORATORIO COMPETENTE, QUE ESTAS MUESTRAS SON CONVENIENTES MEDIANTE UN METODO APROPIADO QUE PUEDA DETERMINAR:

A) EL VOLUMEN MINIMO DE LECHE RECOGIDA QUE PUEDA SER VALIDAMENTE MUESTREADO.

B) LA AUSENCIA DE TODO EFECTO DE ARRASTRE (QUE ESTA LIGADO AL VOLUMEN MINIMO RECOGIDO).

C) LA CAPACIDAD DEL MUESTREADOR DE SUMINISTRAR UNA MUESTRA REPRESENTATIVA DE LA MASA DEL PRODUCTO, DESPUES DE UNA AGITACION ADECUADA.

D) ADEMAS, COMO ESTE TIPO DE MATERIAL ESTA FRECUENTEMENTE CONSIDERADO COMO APROPIADO, AUN CUANDO LA LECHE NO ESTE BIEN MEZCLADA, ESTA AFIRMACION DEBE COMPROBARSE POR EL LABORATORIO DE ENSAYOS.

A.6 CONSERVACION, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

LAS CONDICIONES DE CONSERVACION, DE ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS DE LECHE SERA ESTABLECIDAS POR EL LABORATORIO DE ANALISIS, EN FUNCION DEL METODO DE ANALISIS A APLICAR.

A.6.1 CONSERVACION.

EL EMPLEO DE CONSERVADORES RESPETARA LA REGLAMENTACION EN VIGOR DE CADA PAIS.

A.6.2 ALMACENAMIENTO.

A.6.2.1 MUESTRAS SIMPLES.-SALVO INSTRUCCIONES CONTRARIAS (POR EJEMPLO, PARA EL ENSAYO DE REDUCTASA), SE ALMACENARAN LAS MUESTRAS CON O SIN CONSERVADORES INMEDIATAMENTE DESPUES DEL MUESTREO, PARA ASEGURAR UN ENFRIAMIENTO RAPIDO. NORMALMENTE, NO SE DEBEN AÑADIR CONSERVADORES A LAS MUESTRAS DESTINADAS PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO O SENSORIAL. A ACIERTOS PRODUCTOS LACTEOS PUEDE AÑADIRSE UN CONSERVADOR APROPIADO A CONDICION DE QUE:

A) EL LABORATORIO DE ENSAYOS HAYA DADO INSTRUCCIONES EN ESTE SENTIDO.

B) EL CONSERVADOR NO INFLUYA EN LOS RESULTADOS DE ANALISIS.

C) LA NATURALEZA Y LA CANTIDAD DEL PRODUCTO AÑADIDO SE INDIQUEN EN LA ETIQUETA Y EN EL INFORME O ACTA.

LA TABLA I INDICA SI SE PUEDEN AÑADIR CONSERVADORES Y PROPORCIONA LAS TEMPERATURAS DE ALMACENAMIENTO RECOMENDADAS, ANTES DEL TRANSPORTE, PARA LAS MUESTRAS DE DIVERSOS PRODUCTOS LACTEOS. LA TEMPERATURA DE ALMACENAMIENTO DEBE ALCANZARSE LO MAS RAPIDAMENTE POSIBLE DESPUES DEL MUESTREO.

EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO QUE PRECEDE AL TRANSPORTE SERA LO MAS BREVE POSIBLE. PREFERENTEMENTE, LAS MUESTRAS SE ENVIARAN AL LABORATORIO DE ANALISIS, DENTRO DE LAS VEINTICUATRO HORAS SIGUIENTES AL MUESTREO.

PODRAN UTILIZARSE TEMPERATURAS DE ALMACENAMIENTO DISTINTAS DE LAS RECOMENDADAS EN LA TABLA I, CUANDO EL LABORATORIO DE ANALISIS ASI LO SOLICITE.

NOTA: EL TIEMPO Y LA TEMPERATURA NO DEBEN SER CONSIDERADOS AISLADAMENTE, SINO GLOBALMENTE.

A.6.2.2 MUESTRAS COMPUESTAS.-EN ALGUNOS CASOS, LA COMPOSICION DE LA LECHE DE LOS SUMINISTRADORES SE DETERMINA SOBRE LA BASE DE MUESTRA COMPUESTA TOMADA EN UN PERIODO DE DIEZ A QUINCE DIAS, ALGUNAS VECES HASTA UN MES, Y PREPARADA AÑADIENDO CADA DIA (MAS O MENOS FRECUENTEMENTE) CIERTA CANTIDAD DE MUESTRAS DE LECHE FRESCA, PROPORCIONALMENTE A LA MASA O AL VOLUMEN DE LAS PARTIDAS DE LECHE. TAL METODO PUEDE SER UNA FUENTE DE DIFICULTADES EN RAZON DEL DILATADO PERIODO DE ALMACENAMIENTO, ASI COMO EL CALENTAMIENTO Y MEZCLA PERIODICA DE LA MUESTRA EN EL MOMENTO EN QUE SE AÑADE UNA NUEVA MUESTRA DE LECHE A LA MUESTRA COMPUESTA. SIN EMBARGO, SI SE RECURRE A LAS MUESTRAS COMPUESTAS, SE LAS ALMACENA A 4. C (PREFERENTEMENTE DE 0 A 2. C), DESPUES DE LA ADICION DE UN CONSERVADOR ADECUADO, EN UN RECIPIENTE HERMETICAMENTE CERRADO. CUANDO SE AÑADE UNA NUEVA MUESTRA DE LECHE, SE MEZCLARA CONVENIENTEMENTE LA MUESTRA COMPUESTA Y SE ENFRIARA INMEDIATAMENTE DESPUES. SE ACONSEJA, INSISTENTEMENTE, QUE EL LABORATORIO DE ANALISIS COMPRUEBE REGULARMENTE, RECURRIENDO A UN METODO ADECUADO, QUE LA MUESTRA COMPUESTA NO HA SIDO ORIGEN DE BATIDO NI DE EXUDACION DE LA MATERIA AGRASA DE LA LECHE, CON EL FIN DE DESCUBRIR LA LIPOLISIS O UNA PROTEOLISIS SUSCEPTIBLE DE AFECTAR LOS RESULTADOS DEL ANALISIS.

A.6.3 TRANSPORTE.

LAS MUESTRAS DEBEN EXPEDIRSE AL LABORATORIO DE ANALISIS LO MAS RAPIDAMENTE POSIBLE DESPUES DEL MUESTREO (PREFERENTEMENTE DENTRO DE LAS VEINTICUATRO HORAS). DURANTE EL TRANSPORTE SE TOMARAN PRECAUCIONES PARA QUE NO ESTEN EXPUESTAS A OLORES CONTAMINANTES, LUZ SOLAR DIRECTA O A TEMPERATURAS INFERIORES O SUPERIORES A LAS QUE FIGURAN EN LA TABLA I, O A LAS SOLICITADAS, LLEGADO EL CASO, POR EL LABORATORIO DE ANALISIS.

(CUADRO OMITIDO)

ANEJO 2

METODO DE RUTINA PARA LA DETERMINACION DEL CONTENIDO EN PROTEINAS EN LECHE POR EL METODO DE NEGRO AMIDO

NORMA ESPAÑOLA UNE 34-835/1985

1. OBJETO Y AMBITO DE APLICACION

LA PRESENTE NORMA ESPECIFICA UN METODO DE RUTINA QUE UTILIZA EL NEGRO AMIDO PARA LA DETERMINACION DEL CONTENIDO EN PROTEINAS DE LA LECHE.

COMO LA COMPOSICION DEL COLORANTE NEGRO AMIDO PUEDE VARIAR, EL METODO DESCRITO ES EMPIRICO Y DEPENDE DE UNA REFERENCIA CONSTANTE AL CONTENIDO EN PROTEINAS, DEDUCIDO DE LA DETERMINACION DEL CONTENIDO EN NITROGENO DE LA LECHE POR UN METODO DE REFERENCIA (UNE 34-823). EL METODO ES APLICABLE A LA LECHE CRUDA O A LA TRATADA (PASTERIZADA, HOMOGENEIZADA, ESTERILIZADA, RECONSTITUIDA), ENTERA, DESNATADA, PARCIALMENTE DESNATADA, SIEMPRE QUE LAS MUESTRAS ESTEN EN PERFECTO ESTADO DE CONSERVACION. TAMBIEN ES APLICABLE, BAJO CIERTAS CONDICIONES, A LAS MUESTRAS QUE LLEVEN INCORPORADAS CONSERVADORES (VER 10.1).

PUEDEN REALIZARSE DETERMINACIONES EN SERIE. EN ESTE CASO, SIEMPRE SE DEBE TENER CUIDADO CON CIERTOS FACTORES ESPECIALES QUE SE DESCRIBEN EN EL ANEXO B.

NOTA: SEGUN EL ORIGEN DE LA MUESTRA Y EL METODO DE REFERENCIA UTILIZADO, EL METODO AL NEGRO AMIDO DESCRITO EN LA PRESENTE NORMA PUEDE UTILIZARSE NO SOLAMENTE PARA LA DETERMINACION HABITUAL DEL CONTENIDO EN PROTEINAS DE LA LECHE (NTOTAL X 6,38), SINO TAMBIEN PARA LA DETERMINACION DEL CONTENIDO EN "PROTEINAS VERDADERAS", E, INCLUSO, EN UNA VERSION MODIFICADA, PARA LA DETERMINACION DE LAS PROTEINAS DE LA CASEINA O DEL SUERO, TANTO EN LECHE DE VACA COMO EN LECHE DE OTRAS ESPECIES ANIMALES (CABRA, OVEJA, ETCETERA).

2. REFERENCIAS

UNE 34-823. "LECHE. DETERMINACION DEL CONTENIDO EN NITROGENO TOTAL POR EL METODO KJELDHAL".

UNE 34-828. "LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS. GUIA DE LAS TECNICAS DE MUESTREO".

3. DEFINICION

CONTENIDO EN PROTEINAS: VALOR CONVENCIONAL OBTENIDO MULTIPLICANDO POR UN FACTOR APROPIADO EL CONTENIDO EN NITROGENO TOTAL, EXPRESADO EN PORCENTAJE DE MASA Y DETERMINADO SEGUN EL METODO DE REFERENCIA (UNE 34-823).

NOTA: EN AUSENCIA DE UN ACUERDO INTERNACIONAL SOBRE LA DEFINICION DE TERMINOS, "CONTENIDO EN PROTEINAS" Y "CONTENIDO EN PROTEINAS VERDADERAS", UTILIZADOS EN LA PRESENTE NORMA SE CORRESPONDE CON LAS EXPRESIONES "PORCENTAJE DE SUSTANCIAS NITROGENADAS TOTALES" (NTOTAL X 6,38) Y "PORCENTAJE DE PROTEINAS" (NTOTAL - NNNP) X 6,38 SIENDO NNP LA SUSTANCIA NITROGENADA NO PROTEICA.

4. PRINCIPIO

FORMACION DE UN COMPLEJO INSOLUBLE COLORANTE-PROTEINAS POR ADICION EN EXCESO DE UNA SOLUCION DE NEGRO AMIDO, TAMPONADO A PH 2,4 A UNA TOMA PARA ENSAYO DE LECHE. DESPUES DE LA ELIMINACION DEL COMPLEJO INSOLUBLE POR CENTRIFUGACION (O POR FILTRACION), SE DETERMINA EL CONTENIDO EN PROTEINAS MIDIENDO LA ABSORCION DE LA SOLUCION.

5. REACTIVOS

TODOS LOS REACTIVOS DEBEN SER DE CALIDAD ANALITICA (SALVO SI SE INDICA LO CONTRARIO). EL AGUA SERA DESTILADA O DE PUREZA EQUIVALENTE.

NOTA: LOS IONES CALCIO PRODUCEN INTERFERENCIAS.

5.1 COLORANTE NEGRO AMIDO 10 B (NEGRO ACIDO 1, CI 20.470) PARA ANALISIS DE LECHE. CONTENIDO EN AGUA INFERIOR A 5 POR 100 (M/M).

NOTA: ESTE COLORANTE ES HIGROSCOPICO Y DEBE PROTEGERSE CONTRA UNA RECUPERACION EVENTUAL DE LA HUMEDAD.

5.2 SOLUCION DE NEGRO AMIDO.

EN UN MATRAZ AFORADO DE 1.000 MILILITROS (6,10), AÑADIR UNOS 600 MILILITROS DE AGUA, 0,900 GRAMOS COMO MINIMO DE NEGRO AMIDO 10 B (5.1) (VER ANEXO A1), 2,08 GRAMOS DE HIDROGENOFOSFATO DISODICO DIHIDRATADO (NA2 H PO4 2H2O) Y 15,8 GRAMOS DE ACIDO CITRICO C6 H8 O7 H2 O).

MEZCLAR CUIDADOSAMENTE AGITANDO DURANTE DOS HORAS HASTA UNA DISOLUCION COMPLETA. MEDIANTE EL PH-METRO (6.9) CONTROLAR EL PH QUE DEBE SITUARSE EN LOS LIMITES DE 2,40 +- 0,10, AJUSTANDOLO, SI ES NECESARIO, POR ADICION DE ACIDO SULFURICO O DE HIDROXIDO SODICO. COMPLETAR A 1.000 MILILITOS Y AGITAR DURANTE QUINCE MINUTOS. ANTES DE SU UTILIZACION, DEJAR REPOSAR LA SOLUCION DURANTE UNA NOCHE.

SI LA SOLUCION NO SE VA A UTILIZAR EN VARIOS DIAS, CONSERVARLA AÑADIENDO 0,1 MILILITRO DE UNA SOLUCION DE TIMOL AL 5 POR 100 EN ALCOHOL ETILICO DEL 94-97 POR 100 (V/V).

5.3 SOLUCIONES DE REFERENCIA DE NEGRO AMIDO.

PREPARAR COMO SE INDICA A CONTINUACION DILUCIONES (M/M) A PARTIR DE LA SOLUCION 5.2.

5.3.1 AÑADIR A 10 PARTES DE LA SOLUCION 5.2, 90 PARTES DE AGUA.

ESTA SOLUCION SE UTILIZA EN LUGAR DE AGUA, PARA REGULAR EL COLORIMETRO (6.6) AL CERO DE LA ESCALA, DE ESTA MANERA PUEDE UTILIZARSE LA PARTE DE LA ESCALA LOGARITMICA DONDE LAS DIVISIONES SON MAS AMPLIAS.

5.3.2 AÑADIR A 50 PARTES DE LA SOLUCION 5.2, 50 PARTES DE AGUA.

5.3.3 AÑADIR A 20 PARTES DE LA SOLUCION 5.2, 80 PARTES DE AGUA.

NOTA: LAS SOLUCIONES 5.3.2 Y 5.3.3 CORRESPONDEN A CONTENIDOS EN PROTEINAS BAJOS Y ALTOS Y PROPORCIONARAN LOS VALORES CORRESPONDIENTES A LOS INSTRUMENTOS.

5. SOLUCIONES TAMPON NORMALES PARA PH-METRO.

6. INSTRUMENTAL

TODOS LOS INSTRUMENTOS DESTINADOS A ESTAR EN CONTACTO CON LOS REACTIVOS O CON LA SOLUCION COLORANTE, DEBEN ESTAR CONSTRUIDOS CON MATERIALES NO ATACABLES EN LAS CONDICIONES DEL ANALISIS Y QUE NO ABSORBAN COLORANTE EN CANTIDAD TAL QUE SE AFECTEN LOS RESULTADOS.

6.1 TUBOS DE ENSAYO O DE CENTRIFUGA CON TAPONES DE GOMA.

6.2 GRADILLA O SOPORTE PARA LOS TUBOS 6.1.

6.3 PIPETA O JERINGA QUE PERMITA MEDIR UN VOLUMEN DE 1 +- 0,003 MILILITROS DE LECHE (VER NOTA EN 6.4).

6.4 PIPETA O JERINGA QUE PERMITA MEDIR UN VOLUMEN DE 20 +- 0,02 MILILITROS DE LA SOLUCION DE NEGRO AMIDO.

NOTA: PUEDEN UTILIZARSE PIPETAS Y JERINGAS (6.3 Y 6.4) DE CAPACIDAD DIFERENTE, SIEMPRE QUE LA RELACION ENTRE EL VOLUMEN DE LECHE (VER 8.2.1) Y EL DE LA SOLUCION DE NEGRO AMIDO (VER 8.2.2) SEA DE 1:20 Y LA CONCENTRACION DE NEGRO AMIDO EN EL LIQUIDO SOBRENADANTE (VER 8.2.4) SEA SUPERIOR A 0,1 GRAMOS/LITRO.

6.5 AGITADOR MECANICO O MEZCLADOR ROTATIVO O MEZCLADOR DE AIRE COMPRIMIDO.

NOTA: ESTE APARATO ES FACULTATIVO.

6.6 COLORIMETRO O ESPECTROFOTOMETRO, CON UNA CUBETA (PREFERENTEMENTE DE FLUJO CONTINUO) DE 1,0 MILIMETROS DE RECORRIDO OPTICO Y QUE PERMITA TRABAJAR EN LONGITUDES DE ONDA DE 550 A 620 NANOMETROS.

NOTA: NO ES NECESARIO OPERAR A LA LONGITUD DE ONDA QUE CORRESPONDA EXACTAMENTE A LA SENSIBILIDAD MAXIMA, LA EXPERIENCIA HA DEMOSTRADO QUE LAS DESVIACIONES PUEDEN COMPENSARSE POR CALIBRACION (VER 8.3 Y ANEXO A2).

6.7 CENTRIFUGA CON PORTA-TUBOS OSCILANTES. DEBE PODER ALCANZAR, EN DOS MINUTOS UNA ACELERACION DE 350 +- G EN LA EXTREMIDAD INFERIOR DEL TUBO DE ENSAYO. TAL ACELERACION ES PRODUCIDA POR LAS CENTRIFUGAS CUYO RADIO UTIL (DISTANCIA HORIZONTAL ENTRE EL CENTRO DEL EJE DE LA CENTRIFUGA Y LA EXTREMIDAD INFERIOR DEL TUBO DE ENSAYO) FIGURA EN LA TABLA SIGUIENTE Y QUE FUNCIONAN A LA VELOCIDAD INDICADA.

RADIO UTIL MM/R/MIN

240/1.405

245/1.130

250/1.120

255/1.110

260/1.100

265/1.090

270/1.080

275/1.070

300/1.020

325/980

NOTA: LA ACELERACION CENTRIFUGA RELATIVA PUEDE CALCULARSE MEDIANTE LA FORMULA:

(FORMULA OMITIDA)

EN LA QUE

R = RADIO HORIZONTAL UTIL, EN MILIMETROS.

N = VELOCIDAD EN REVOLUCIONES POR MINUTO.

6.8 BALANZA DE PRECISION, DE 0,1 MILIGRAMO DE SENSIBILIDAD.

6.9 PH-METRO, CON ELECTRODO DE VIDRIO Y ELECTRODO DE REFERENCIA Y QUE PERMITA LECTURAS CON PRECISION DE 0,01 UNIDADES DE PH.

6.10 MATRACES AFORADOS, DE 1.000 MILILITROS DE CAPACIDAD.

7. MUESTREO

SE REALIZARA DE ACUERDO CON LO ESTABLECIDO EN LA NORMA UNE 34-828.

8. PROCEDIMIENTO OPERATORIO

LLEVAR LA MUESTRA A UNA TEMPERATURA DE 20 A 30. C, EN EL BAÑO MARIA, SI ES NECESARIO. MEZCLAR LA LECHE CUIDADOSAMENTE, INVIRTIENDO 3 O 4 VECES EL MATRAZ DE MUESTREO Y EVITANDO LA FORMACION DE ESPUMA Y EL BATIDO DE LA GRASA. SI RESULTA DIFICIL DISPERSAR UNA CAPA DE NATA O SI LA LECHE APARECE LIGERAMENTE BATIDA, CALENTAR LENTAMENTE EN EL BAÑO MARIA HASTA UNA TEMPERATURA DE 35 A 40.C Y MEZCLAR SUAVEMENTE, SI ES NECESARIO UTILIZAR UN HOMOGENEIZADOR APROPIADO PARA DISPERSAR MEJOR LA GRASA. UNA VEZ OBTENIDA UNA DISPERSION UNIFORME DE LA GRASA, LLEVARLA RAPIDAMENTE A 20. C. DESPUES DE HABER ALCANZADO LA TEMPERATURA DEFINITIVA DE LA LECHE, DEJARLA REPOSAR PARA QUE SE LIBEREN LAS BURBUJAS DE AIRE.

8.2 DETERMINACION.

8.2.1 MEDIANTE UNA PIPETA O JERINGA (6.3), INTRODUCIR 1 MILILITRO DE LA MUESTRA PREPARADA (8.1) EN UN TUBO DE ENSAYO O DE CENTRIFUGA (6.1).

8.2.2 AÑADIR, CON UNA PIPETA O JERINGA (6.4), 20 MILILITROS DE LA SOLUCION DE NEGRO AMIDO (5.2), A LA MUESTRA QUE SE ENCUENTRA EN EL TUBO DE ENSAYO O DE CENTRIFUGA (6.1). TAPAR EL TUBO, SI ES NECESARIO, Y MEZCLAR EL CONTENIDO DURANTE TREINTA SEGUNDOS AGITANDO, A MANO O MEDIANTE UN DISPOSITIVO MECANICO (6.5), CON UNA AMPLITUD DE UNOS 25 CENTIMETROS. SE PUEDE UTILIZAR AIRE COMPRIMIDO PARA OBTENER UN EFECTO SEMEJANTE EN EL TUBO DE ENSAYO O DE CENTRIFUGA.

8.2.3 DESTAPAR EL TUBO, COLOCARLO EN LA CENTRIFUGA (6.7) Y CENTRIFUGARLO DURANTE DOS MINUTOS, COMO MINIMO, UNA VEZ SE HAYA ALCANZADO EN EL FONDO DEL TUBO UNA ACELERACION DE 350 +- 50 G.

8.2.4 INTRODUCIR EL LIQUIDO SOBRENADANTE DE LOS TUBOS DE LA CUBETA DEL COLORIMETRO Y EFECTUAR LA LECTURA DE ABSORCION, DESPUES DE HABER REGULADO EL COLORIMETRO O EL ESPECTROFOTOMETRO (6.6) AL CERO DE LA ESCALA, UTILIZANDO LA SOLUCION DE REFERENCIA AL NEGRO AMIDO (5.3.1) A LA LONGITUD DE ONDA ESCOGIDA (VER 6.6).

8.3 CURVA DE CALIBRADO.

TOMAR, COMO MINIMO, 40 MUESTRAS DE DIFERENTES LECHES, QUE PROCEDAN, SI ES POSIBLE, DE DISTINTAS VACAS, QUE PRESENTEN UN CONTENIDO EN PROTEINAS DE 2,5 A 4,5 (M/M) O MAS (VER NOTA) Y DETERMNAR EL CONTENIDO EN PROTEINAS DE CADA UNA DE ELLAS APLICANDO EL METODO DE REFERENCIA (UNE 34-823). PARALELAMENTE, UTILIZANDO EL METODO DE NEGRO AMIDO DESCRITO EN LA PRESENTE NORMA, ANOTAR LA LECTURA DE LA ESCALA DE COLORIMETRO (6.6) OBTENIDA PARA CADA MUESTRA, CON EL LIQUIDO SOBRENADANTE PROCEDENTE DEL ANALISIS.

MEDIANTE UNA GRAFICA QUE REPRESENTE LAS LECTURAS DE LA ESCALA EN FUNCION DE LOS CONTENIDOS EN PROTEINAS OBTENIDOS POR EL METODO DE REFERENCIA, ANOTAR LOS PUNTOS EN QUE SE INTERRUMPE LA RELACION LINEAL Y ELIMINAR LOS RESULTADOS QUE SE SITUEN MAS ALLA DE ESTOS PUNTOS PARA EL CALCULO DE LA RECTA DE REGRESION (VER 10.2).

CALCULAR LA RECTA DE REGRESION PARA LAS LECTURAS DE LA ESCALA EN FUNCION DE LOS CONTENIDOS EN PROTEINAS (OBTENIDOS POR EL METODO DE REFERENCIA), Y TRAZAR LA CURVA DE CALIBRADO.

NOTA: LAS LECHES RECONSTITUIDAS QUE HAYAN SUFRIDO UN TRATAMIENTO TERMICO (PASTERIZADAS O ESTERILIZADAS), PUEDEN NECESITAR CURVAS DE CALIBRADO DIFERENTES.

8.4 SOLUCIONES DE REFERENCIA.

MIENTRAS QUE SE OBTIENE LA CURVA DE CALIBRADO, EFECTUAR LAS LECTURAS PARA LAS DOS SOLUCIONES DE COLORANTE PREPARADOS, TAL COMO SE HA INDICADO EN 5.3.2 Y 5.3.3 (VER ANEXO A1).

9. EXPRESION DE LOS RESULTADOS

EL CONTENIDO EN PROTEINAS SE CALCULA A PARTIR DE LA LECTURA DE LA ESCALA, UTILIZANDO LA CURVA DE CALIBRADO (VER 8.3) Y EL RESULTADO SE EXPRESA EN GRAMOS DE PROTEINAS POR 100 GRAMOS DE MUESTRA.

10. REPETIBILIDAD

LA DIFERENCIA ENTRE LOS RESULTADOS OBTENIDOS DE DOS DETERMINACIONES EFECTUADAS SIMULTANEA O INMEDIATAMENTE UNA DESPUES DE LA OTRA POR EL MISMO ANALISTA, NO DEBE SER SUPERIOR A 0,03 GRAMOS DE PROTEINAS POR 100 GRAMOS DE MUESTRA.

11. CASOS PARTICULARES

11.1 MUESTRAS CON ADICION DE CONSERVADORES

EL METODO PUEDE APLICARSE SIN MODIFICACION A LAS MUESTRAS CON CLORURO DE MERCURIO (II) A RAZON DE 0,07 A 0,1 POR 100 (M/M). CUANDO LO PERMITAN LOS REGLAMENTOS ANTIPOLUCION, O CON AZIDA DE SODIO DE 0,02 A 0,3 POR 100 (M/M). PARA LAS MUESTRAS CON 0,1 POR 100 (M/M) DE DICROMATO POTASICO, EL METODO PUEDE UTILIZARSE SOLAMENTE CUANDO EL TIEMPO TRANSCURRIDO ENTRE LA ADICION DE LA SOLUCION DE NEGRO AMIDO A LA LECHE Y LA LECTURA EN EL COLORIMETRO, ES MUY CORTO, COMO ES EL CASO POR EL METODO DE FILTRACION (VER ANEXO B); EL METODO POR CENTRIFUGACION NO ES ACONSEJABLE. TAMPOCO ES ACONSEJABLE EL METODO PARA LAS MUESTRAS ADICIONADAS DE FORMOL.

11.2 DESVIACION DE LA LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRADO.

LAS LECHES CUYOS CONTENIDOS EN PROTEINAS NO ESTAN DE ACUERDO CON LA LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRADO (8.3) DEBEN TRATARSE COMO SE INDICA A CONTINUACION:

PREPARAR UNA NUEVA CURVA DE CALIBRADO PIPETEANDO UNA CANTIDAD DE LECHE INFERIOR EN 0,1 MILILITRO A LA UTILIZADA NORMALMENTE (VER 8.3). IGUALMENTE, EFECTUAR UNA TOMA DE ENSAYO INFERIOR EN 0,1 MILILITRO A LAS TOMADAS NORMALMENTE, CUANDO SE TRATA DE APLICAR A LA MUESTRA A ANALIZAR, EL METODO AL NEGRO AMIDO.

12. INFORME DEL ANALISIS

EL INFORME DEL ANALISIS DEBE INDICAR EL METODO UTILIZADO Y LOS RESULTADOS OBTENIDOS.

DEBEN MENCIONAR:

A) EL FACTOR UTILIZADO PARA CALCULAR EL CONTENIDO EN PROTEINAS, A PARTIR DEL CONTENIDO EN NITROGENO DETERMINADO MEDIANTE EL METODO DE REFERENCIA (UNE 34- 823).

B) CUALQUIER DETALLE SUSCEPTIBLE DE INDICAR SI LA PRECISION DEL RESULTADO ES DUDOSA.

C) TODOS LOS DATOS NECESARIOS PARA LA IDENTIFICACION COMPLETA DE LA MUESTRA.

13. CORRESPONDENCIA

LA PRESENTE NORMA SE CORRESPONDE CON LA NORMA INTERNACIONAL FIL 98:1980 (PROVISIONAL).

ANEXO A

CONTROL DE CALIBRADO

A.1 SOLUCION AL NEGRO AMIDO.

COMO LA CONCENTRACION DE NEGRO AMIDO PUEDE VARIAR DE UNA PARTIDA A OTRA, ES NECESARIO ADAPTAR ESTA CONCENTRACION (5.2), PARA CADA NUEVA PARTIDA (VER NOTA), CON EL FIN DE PODER OBTENER, CON LAS SOLUCIONES PREPARADAS EN 5.3.2 Y 5.3.3, LECTURAS DE LA ESCALA IDENTICAS A LAS OBTENIDAS DURANTE EL CALIBRADO (VER 8.4). CONVIENE PROCEDER A UNA ULTIMA COMPROBACION Y AJUSTE MEDIANTE UNA MUESTA DE CONTROL REPRESENTATIVA DE UNA CANTIDAD IMPORTANTE DE LECHE, CUYO CONTENIDO EN PROTEINAS SE HA DETERMINADO SEGUN EL METODO DE REFERENCIA (UNE 34-823).

NOTA: CONVIENE EFECTUAR CUALQUIER DILUCION MEDIANTE LA SOLUCION TAMPONADA ESPECIFICADA EN 5.2.

A.2 MUESTRAS DE LECHE DE CONTROL.

EL CALIBRADO PUEDE VERSE AFECTADO POR LOS CAMBIOS ESTACIONALES DE LA COMPOSICION DE LAS DIFERENTES FRACCIONES NITROGENADAS DE LA LECHE, POR LO QUE CONVIENE COMPROBAR REGULARMENTE SU VALIDEZ. ESTO SE REALIZA MEDIANTE, AL MENOS, UNA MUESTRA REPRESENTATIVA DE UNA CANTIDAD IMPORTANTE DE LECHE (PROCEDENTE DE UN GRAN NUMERO DE VACAS), DE UN CONTENIDO MEDIO EN PROTEINAS O PREFERIBLEMENTE MEDIANTE DOS DE ESTAS MUESTRAS, UNA CON UN BAJO CONTENIDO EN PROTEINAS Y LA OTRA CON UN CONTENIDO ELEVADO. EL CONTENIDO EN PROTEINAS DE ESTAS MUESTRAS SE HABRA DETERMINADO SEGUN EL METODO DE REFERENCIA (UNE 34-823) A PARTIR DEL CONTENIDO EN NITROGENO TOTAL.

ANEXO B

DETERMINACIONES EN SERIE

B.1 INSTRUMENTAL.

CUALQUIER APARATO DE PIPETEADO MULTIPLE QUE SE UTILICE PARA ESTE FIN, RESPONDERA A LAS MISMAS CONDICIONES QUE LAS DESCRITAS EN LA PRESENTE NORMA PARA EL METODO DE PIPETA UNICA.

B.2 FILTRACION.

EN LUGAR DE CENTRIFUGACION PUEDE UTILIZARSE LA FILTRACION A TRAVES DE UN FILTRO DE FIBRA DE VIDRIO, PREFERENTEMENTE SILICONADO, AYUDANDOSE CON UNA LIGERA PRESION. ES NECESARIO COMPROBAR QUE LA CANTIDAD DE COLORANTE ABSORBIDA POR EL FILTRO ES MINIMA Y CONSTANTE EN TODA SU SUPERFICIE. PARA UNA PRESION DETERMINADA, LA POROSIDAD DEL FILTRO DEBE PERMITIR UN FILTRADO CORRECTO DEL PRECIPITADO FORMADO POR EL COMPLEJO COLORANTE-PROTEINAS.

B.3 MUESTRAS DE LECHE DE CONTROL.

SE TOMARA UN NUMERO SUFICIENTE DE MUESTRAS DE CONTROL DE LAS PROCEDENTES DE LA LECHE MENCIONADA EN EL ANEXO A.2. SE LES AÑADIRA UN CONSERVADOR (VER 11.1) DE FORMA QUE SE PUEDAN UTILIZAR DURANTE CIERTO NUMERO DE DIAS SIN QUE EL VALOR DE REFERENCIA DEL CONTENIDO EN PROTEINAS SE MODIFIQUE POR DETERIORO. LAS MUESTRAS DE CONTROL DEBEN ANALIZARSE DOS VECES, ANTES DE ANALIZAR LAS DE RUTINA. DEBEN INCLUIRSE, NORMALMENTE, EN CADA SERIE A RAZON DE 1 POR 10, O INTERPONERLAS A INTERVALOS REGULARES DURANTE LOS ANALISIS EN SERIE. IGUALMENTE ES NECESARIO COMPROBAR LAS LECTURAS DE LA ESCALA DEL COLORIMETRO MEDIANTE LAS SOLUCIONES DE REFERENCIA DEL COLORANTE PARA LAS QUE ESTAS LECTURAS SE DETERMINARON DURANTE EL CALIBRADO (VER 8.4 Y ANEXO A.2).

ANEJO 3

RECUENTO DE MICROORGANISMOS (TECNICAS POR RECUENTO DE COLONIAS A 30. C EN LECHE LIQUIDA)

NORMA ESPAÑOLA UNE 34-805/1983

1. OBJETO Y AMBITO DE APLICACION

LA PRESENTE NORMA DESCRIBE UN METODO DE RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN LA LECHE LIQUIDA POR LA TECNICA DE RECUENTO DE COLONIAS A 30. C.

EL METODO ES APLICABLE A LA LECHE CRUDA Y A LA TRATADA POR EL CALOR.

2. REFERENCIAS

UNE 34-828. LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS. GUIA DE LAS TECNICAS DE MUESTREO.

3. DEFINICION

PARA LAS NECESIDADES DE LA PRESENTE NORMA, SE ENTIENDE POR MICROORGANISMOS AQUELLOS ORGANISMOS QUE FORMAN COLONIAS CUANDO SE LES INCUBA A 30. C EN LAS CONDICIONES OPERATORIAS DESCRITAS A CONTINUACION.

4. PRINCIPIO

SIEMBRA, EN PLACAS PETRI, DE UN MEDIO DE CULTIVO CON UNA TOMA PARA ENSAYO DETERMINADA O CON SERIES DE DILUCIONES DECIMALES E INCUBACION DE LAS PLACAS A 30. C DURANTE SETENTA Y DOS HORAS. RECUENTO DE COLONIAS Y CALCULO DEL NUMERO DE MICROORGANISMOS POR MILILITRO DE MUESTRA.

5. REACTIVOS

5.1. HIDROXIDO SODICO, SOLUCION 1 M APROXIMADAMENTE.

5.2. ACIDO CLORHIDRICO, SOLUCION 1 M APROXIMADAMENTE.

6. INSTRUMENTAL

MATERIAL CORRIENTE DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Y

6.1. AUTOCLAVE, QUE PERMITA OPERAR A 121 +- 1. C.

6.2. HORNO DE AIRE CALIENTE, QUE PERMITA OPERAR HASTA 170. C.

6.3. ESTUFA, QUE PERMITA MANTENER UNA TEMPERATURA UNIFORME DE 30 +- 1.C. 6.4

PH-METRO, CON COMPENSACION DE TEMPERATURA Y PRECISION DE 0,1 UNIDAD PH. 6.5

BALANZA DE PRECISION, SENSIBILIDAD 0,01 GRAMO.

6.6. BAÑO DE AGUA, QUE PERMITA OPERAR A 45 +- 1. C.

6.7. LUPA DE 2-4 X AUMENTOS.

6.8. LUPA DE 8-10 X AUMENTOS.

6.9. MATRACES PARA DILUCION, DE 150-250 MILILITROS DE CAPACIDAD, O PROBETAS DE UNOS 20 MILILITROS DE CAPACIDAD, PROVISTAS DE CAPSULAS O DE TAPONES DE CAUCHO O DE MATERIAL SINTETICO ADECUADO. UNA VARILLA DE VIDRIO O DE ACERO HUNDIDA EN EL TAPON DEL MATRAZ FACILITA SU RETIRADA.

NOTA: EL MATERIAL DE VIDRIO DEBE SER ESTERILIZABLE.

6.10. MATRACES DE 150-250 MILILITROS DE CAPACIDAD, O PROBETAS DE UNOS 20 MILILITROS DE CAPACIDAD, DESTINADOS A CONTENER EL MEDIO DE CULTIVO.

6.11. PIPETAS GRADUADAS, CON LA EXTREMIDAD NO DESPORTILLADA, CALIBRADAS PARA LIBERAR 1,00 +- 0,02 MILILITROS, 10,0 +- 0,2 MILILITROS Y 11,0 +- 0,2 MILILITROS.

6.12. PLACAS PETRI, DE VIDRIO NO COLOREADO; LA PLACA INFERIOR TENDRA UN DIAMETRO INTERIOR APROXIMADO DE 90 MILIMETROS. LA PROFUNDIDAD INTERIOR DEBE SER COMO MINIMO DE 10 MILIMETROS. EL FONDO NO DEBE PRESENTAR NINGUNA IRREGULARIDAD QUE INTERFIERA DURANTE EL RECUENTO DE LAS COLONIAS.

NOTA: PUEDEN UTILIZARSE PIPETAS Y PLACAS PETRI DE MATERIAL SINTETICO, ESTERILIZADAS EN LUGAR DE LAS DE VIDRIO.

6.13. EMBUDOS DE FILTRACION, PARA LA PREPARACION DE LOS MEDIOS.

6.14. PAPEL DE FILTRO RAPIDO, QUE SE ADAPTE A LOS EMBUDOS.

6.15. ALGODON, NO ABSORBENTE, O CELULOSA O TORUNDAS DE ALGODON O CELULOSA LISTAS PARA SU EMPLEO, PARA LOS MATRACES Y TUBOS. EL MATERIAL NO DEBE SER TOXICO DESPUES DE LA ESTERLIZACION.

7. MUESTREO

SE REALIZARA DE ACUERDO CON LO ESTABLECIDO EN LA NORMA UNE 34-828.

8. MEDIO DE CULTIVO

8.1. COMPOSICION.

EXTRACTO DE LEVADURA, 2,5 GRAMOS.

TRIPTONA, 5,0 GRAMOS.

GLUCOSA, 1,0 GRAMO.

LECHE EN POLVO DESNATADA, 1,0 GRAMO.

AGAR-AGAR, 10 A 15 GRAMOS, SEGUN LAS PROPIEDADES GELIFICANTES DEL AGAR-AGAR UTILIZADO.

AGUA, 1.000 MILILITROS.

EL PH, DESPUES DE LA ESTERILIZACION, DEBE SER DE 6,9 +- 0,1 A 30.C.

NOTA: EN TODOS LOS CASOS, ES NECESARIO AÑADIR LA LECHE EN POLVO DESNATADA TANTO SI EL MEDIO DE CULTIVO ESTA COMPRADO YA LISTO PARA SU EMPLEO Y AUN CUANDO EL PROVEEDOR CONSIDERE QUE TAL ADICION ES INUTIL.

8.2. CARACTERISTICAS DE LOS COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO.

8.2.1. EL EXTRACTO DE LEVADURA, TRIPTONA, GLUCOSA (FORMULA OMITIDA) Y AGAR-AGAR DEBE SER DE CALIDAD ADECUADA PARA BACTERIOLOGIA.

8.2.2. LA LECHE EN POLVO DESNATADA DEBE ESTAR EXENTA DE SUSTANCIAS INHIBIDORAS. ESTE PUNTO SE CONFIRMARA MEDIANTE PRUEBAS COMPARATIVAS UTILIZANDO UNA LECHE EN POLVO DESNATADA RECONOCIDA EXENTA DE SUSTANCIAS INHIBIDORAS.

8.2.3. EL AGUA SERA DESTILADA EN UN APARATO ENTERAMETNE DE VIDRIO O DE SILICE PURA. PUEDE UTILIZARSE AGUA DESIONIZADA (DESMINERALIZADA POR INTERCAMBIO IONICO) SI ESTA EXENTA DE SUSTANCIAS TOXICAS.

8.3. PREPARACION.

8.3.1. PREPARACION A PARTIR DE MEDIOS DESHIDRATADOS DEL COMERCIO. SEGUIR LAS PRESCRIPCIONES DEL FABRICANTE PERO AÑADIENDO LECHE EN POLVO DESNATADA (VEASE NOTA 8.1). SI ES NECESARIO, AJUSTAR EL PH A 7,0-7,1 UTILIZANDO LA SOLUCION DEL HIDROXIDO SODICO (5.1) O LA SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO (5.2) PARA OBTENER UN PH REQUERIDO DESPUES DE LA ESTERILIZACION.

8.3.2. PREPARACION A PARTIR DE INGREDIENTES SEPARADOS. DISOLVER Y DISPERSAR EN AGUA EN EL SIGUIENTE ORDEN: EXTRACTO DE LEVADURA, TRIPTONA, GLUCOSA Y, POR ULTIMO, LA LECHE EN POLVO DESNATADA. EL CALENTAMIENTO DEL AGUA FACILITA ESTA OPERACION. AÑADIR AGAR-AGAR Y LLEVAR A EBULLICION AGITANDO FRECUENTEMENTE, HASTA QUE EL AGAR-AGAR ESTE COMPLETAMENTE FUNDIDO O CALENTAR AL VAPOR DURANTE TREINTA MINUTOS.

FILTRAR SOBRE PAPEL DE FILTRO, SI ES NECESARIO. AJUSTAR EL PH A 7,0-7,1 UTILIZANDO LA SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO (5.1) O LA SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO (5.2) PARA OBTENER EL PH REQUERIDO DESPUES DE LA ESTERILIZACION.

8.3.3. DISTRIBUCION DEL MEDIO. REPARTIR EL MEDIO PREPARADO SEGUN 8.3.1. O 8.3.2 EN LOS MATRACES (6.10) EN CANTIDADES DE 100 A 150 MILILITROS O EN LAS PROBETAS (6.10) EN CANTIDADES DE 10 A 12 MILILITROS. ESTERILIZACION EN AUTOCLAVE (6.1) DURANTE QUINCE MINUTOS A 121 +- 1.C.

COMPROBAR EL PH DEL MEDIO, QUE DEBE SER DE 6,9 +- 0,1 A 30.C. CONSERVAR EL MEDIO EN LA OSCURIDAD, A UNA TEMPERATURA QUE NO SOBREPASE LOS 5.C.

EL MEDIO DEBE UTILIZARSE ANTES DE LOS TRES MESES DE SU PREPARACION.

9. DILUYENTE O SOLUCION DE RINGER

9.1. COMPOSICION (SOLUCION DE RINGER NO DILUIDA).

TODOS LOS PRODUCTOS DEBEN SER DE CALIDAD ANALITICA ADECUADA PARA BACTERIOLOGIA.

CLORURO SODICO (NACL), 9,00 GRAMOS.

CLORURO POTASICO (KCL), 0,42 GRAMOS.

CLORURO CALCIDO, ANHIDRIDO (FORMULA OMITIDA), 0,42 GRAMOS.

BICARBONATO SODICO (FO), 0,20 GRAMOS.

AGUA (PUREZA, VEASE 8.2.3.), 1.000 MILILITROS.

NOTA: EL DILUYENTE PUEDE PREPARARSE TAMBIEN A PARTIR DE PASTILLAS DISPONIBLES EN EL COMERCIO.

9.2. PREPARACION.

9.2.1. PREPARAR LA SOLUCION NO DILUIDA DE RINGER DISOLVIENDO LAS SALES (9.1) EN AGUA Y, ANTES DE SU EMPLEO, DILUIR UNA PARTE DE ESTA SOLUCION CON TRES PARTES DE AGUA PARA OBTENER UNA SOLUCION DE RINGER DILUIDA AL CUARTO.

9.2.2. REPARTIR EN LOS MATRACES PARA DILUCION O EN LOS TUBOS DE ENSAYO (6.9) LA SOLUCION DE RINGER DILUIDA AL CUARTO (9.2.1), DE TAL MANERA QUE DESPUES DE LA ESTERILIZACION CADA MATRAZ CONTENGA 90+- 2 MILILITROS O 99 +- 2 MILILITROS Y 9+-0,2 MILILITROS CADA TUBO.

9.3. ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE (6.1) DURANTE QUINCE MINUTOS A 121 +- 1.C.

NOTA: ALGUNAS VECES SE RECOMIENDA SUSTITUIR LA SOLUCION DE RINGER DILUIDA AL CUARTO POR UNA SOLUCION DE PEPTONA AL 0,1 POR 100, PERO LOS DATOS DISPONIBLES ACTUALMENTE SON INSUFICIENTES PARA JUSTICIAR TAL CAMBIO.

10. PROCEDIMIENTO OPERATORIO

10.1. PREPARACION DEL MATERIAL DE VIDRIO.

ESTERILIZAR LAS PIPETAS (6.11) Y LAS PLACAS PETRI (6.12) EN EL HORNO DE AIRE CALIENTE (6.2) A 170.C DURANTE UNA HORA COMO MINIMO; SI NO SE DISPONE DE HORNO DE AIRE CALIENTE, ESTERILIZAR EN EL AUTOCLAVE DURANTE VEINTE MINUTOS A 121 +- 1.C. LOS RECIPIENTES QUE SE UTILICEN PARA LA ESTERILIZACION DEL MATERIAL EN EL AUTOCLAVE NO DEBEN CERRARSE HERMETICAMENTE. EL MATERIAL DE VIDRIO ESTERILIZADO EN AUTOCLAVE DEBE SECARSE POR EVAPORACION.

10.2 FUSION DEL MEDIO.

ANTES DE PROCEDER AL EXAMEN BACTERIOLOGICO, FUNDIR RAPIDAMETNE LA CANTIDAD REQUERIDA DEL MEDIO EN UN BAÑO DE AGUA HIRVIENTE O BAJO UNA CORRIENTE DE VAPOR EN UN RECIPIENTE PARCIALMENTE CERRADO. ENFRIAR EL MEDIO FUNDIDO EN EL BAÑO DE AGUA (6.6) REGULADO A 45 +- 1.CC.

NOTA: PARA CONTROLAR LA TEMPERATURA DEL AGAR-AGAR, SITUAR UN TERMOMETRO EN UNA SOLUCION DE AGAR-AGAR AL 1,5 POR 100 INTRODUCIDO EN UN RECIENTE IDENTICO AL UTILIZADO PARA EL MEDIO. ESTA SOLUCION DE CONTROL DE LA TEMPERATURA DEBE

CALENTARSE Y ENFRIARSE EN LA MISMA FORMA QUE EL MEDIO.

10.3. PREPARACION DE LA MUESTRA.

CON EL FIN DE ASEGURAR UN REPARTO UNIFORME DE LOS MICROORGANISMOS, MEZCLAR CUIDADOSAMENTE LA MUESTRA, VOLTEANDO RAPIDAMENTE 25 VECES EL RECIPIENTE QUE LA CONTIENE. EN LA PRACTICA AGITAR LAS 25 VECES EN SIETE SEGUNDOS CON UNA AMPLITUD DE 30 CENTIMETROS. IGUALMENTE ES POSIBLE AGITAR LA MUESTRA MECANICAMENTE, SI SE OBTIENE EL MISMO RESULTADO. EL TIEMPO TRANSCURRIDO DESDE LA MEZCLA HASTA LA TOMA PARA ENSAYO NO DEBE SER SUPERIOR A TRES MINUTOS.

SI ES NECESARIO, ANTES DE ABRIR UN RECIPIENTE CON MUESTRA, LIMPIAR EXTERIORMENTE JUNTO A LA ZONA DONDE VA A TOMARSE PARA ELIMINAR TODO LO QUE PUEDA CONTAMINAR LA MUESTRA. ESTA ZONA PUEDE LIMPIARSE CON ALCOHOL ETILICO AL 70 POR 100 PARA PREVENIR ASI TODA CONTAMINACION ULTERIOR. EN OTROS CASOS, UTILIZAR EL PROCEDIMIENTO MAS ADECUADO.

10.4 PREPARACION DE LAS DILUCIONES.

PREPARAR LAS DILUCIONES Y SEMBRAR (VEASE 10.5) PARA OBTENER PLACAS QUE CONTENGAN ENTRE 10 Y 300 COLONIAS.

NOTA: LAS INDICACIONES SIGUIENTES ESTAN BASADAS SOBRE 10 MILILITROS DE MUESTRA EN 90 MILILITROS DE DILUYENTE (DILUCION 1/10). PUEDEN UTILIZARSE OTRAS SERIES DE DILUCIONES COMO 1 MILILITRO DE MUESTRA EN 9 MILILITROS DE DILUYENTE (DILUCION 1/10) U 11 MILILITROS DE MUESTRA EN 99 MILILITROS DE DILUYENTE (DILUCION 1/10).

LA FIDELIDAD Y PRECISION DEL METODO SON MEJORES CUANDO SE UTILIZAN CANTIDADES DE MUESTRA MAS IMPORTANTES.

10.4.1. TOMAR 10 MILILITROS DE MUESTRA CON UNA PIPETA ESTERIL Y AÑADIR 90 MILILITROS DE DILUYENTE (9.3). AGITAR LA MUESTRA DILUIDA. SE OBTIENE DE ESTA MANERA LA DILUCION 1/10.

10.4.2. CON OTRA PIPETA ESTERIL TOMAR 10 MILILITROS DE LA DILUCION 1/10 (10.4.1) AÑADIR 90 MILILITROS DE DILUYENTE (9.3) Y AGITAR. ASI SE OBTIENE LA DILUCION 1/100.

10.4.3. PREPARAR OTRAS DILUCIONES DE LA MISMA MANERA UTILIZANDO UNA PIPIETA ESTERIL PARA CADA DILUCION.

NOTA: NO INTRODUCIR LA PIPETA MAS DE 1 CENTIMETRO POR DEBAJO DE LA SUPERFICIE DEL LIQUIDO. EVITAR INTRODUCIR BURBUJAS DE AIRE EN LA PIPETA. DURANTE LAS TRANSFERENCIAS NO INTRODUCIR LA PIPETA EN EL NUEVO DILUYENTE.

10.5. SIEMBRA DE LAS PLACAS PETRI.

PREPARAR DOS PLACAS PARA CADA DILUCION ESCOGIDA (10.4). TRANSFERIR CON UNA PIPIETA ESTERIL, 1 MILILITRO DE LA MUESTRA Y/O DE LAS DILUCIONES APROPIADAS EN CADA PLACA.

PONER EN CONTACTO LA EXTREMIDAD DE LA PIPETA CON UNA SUPERFICIE SECA EN LA PLACA PETRI. UTILIZAR UNA PIPETA ESTERIL PARA CADA DILUCION TRANSFERIDA A LAS PLACAS.

10.6. DISTRIBUCION DEL AGAR-AGAR EN LAS PLACAS PETRI.

10.6.1. VERTER EN CADA PLACA SEMBRADA DE 10 A 12 MILILITROS DEL MEDIO FUNDIDO A LA TEMPERATRUA DE 45 +- 1.C (10.2).

10.6.2. MEZCLAR INMEDIATAMENTE, POR ROTACION DE LA PLACA PETRI, CON EL FIN DE OBTENER COLONIAS REGULARMENTE DISPERSADAS DESPUES DE LA INCUBACION.

10.6.3. DEJAR REPOSAR LAS PLACAS, EN UNA SUPERFICIE HORIZONTAL Y LIMPIA, HASTA LA SOLIDIFICACION DEL MEDIO, INVERTIRLAS DE POSICION Y SITUARLAS EN LA ESTUFA (6.3) REGULADA A 30.C.

NOTA: EL TIEMPO TRANSCURRIDO ENTRE LA PREPARACION DE LAS DILUCIONES Y LA DISTRIBUCION DEL MEDIO EN LAS PLACAS PETRI NO DEBE EXCEDER DE QUINCE MINUTOS. LAS OPERACIONES DESCRITAS EN LOS APARTADOS 10.3 A 10.6 NO DEBEN EFECTUARSE A LA LUZ SOLAR DIRECTA.

10.7. INCUBACION DE LAS PLACAS PETRI.

LAS PLACAS PETRI EN POSICION INVERTIDA SE PONEN A INCUBAR, APILANDO, 6 O MAS. LAS PILAS DE PLACAS NO DEBEN TOCARSE, NI ESTAR EN CONTACTO CON LAS PAREDES O LA PARTE SUPERIOR DE LA ESTUFA. INCUBAR A 30 +- 1.C DURANTE 72 +- 2 HORAS.

10.8. RECUENTO DE COLONIAS.

10.8.1. CONTAR LAS COLONIAS EN LAS PLACAS PETRI. EXAMINAR LAS PLACAS BAJO LUZ ATENUADA. PARA FACILITAR EL RECUENTO, SE PUEDE UTILIZAR UNA LUPA (6.7) Y/O UN CONTADOR-REGISTRADOR. EVITAR CONFUNDIR LAS PARTICULAS, DE LA MUESTRA, NO DISUELTAS O LAS SUSTANCIAS PRECIPITADAS, CON LAS COLONIAS DEL TAMAÑO DE UNA PUNTA DE ALFILER. EN CASO DE DUDA EXAMINARLAS CON ATENCION UTILIZANDO, SI ES NECESARIO, UNA LUPA MAS POTENTE (6.8).

10.8.2. LAS COLONIAS INVASORAS SE CONSIDERAN COMO COLONIAS UNICAS. SI MENOS DE UN CUARTO DE LA PLACA ESTA RECUBIERTO POR LAS COLONIAS INVASORAS, CONTAR LAS EXISTENTES EN LA PARTE NO AFECTADA DE LA PLACA Y CALCULAR EL NUMERO CORRESPONDIENTE PARA LA PLACA ENTERA.

SI MAS DE UN CUARTO DE LA PLACA ESTUVIERA CUBIERTO DE COLONIAS, ELIMINARLA.

11. EXPRESION DE LOS RESULTADOS

11.1. CALCULO Y FORMULA.

EN PRINCIPIO, UTILIZAR LOS RESULTADOS DE LAS PLACAS QUE CONTENGAN ENTRE 10 Y 300 COLONIAS.

11.2. CALCULAR EL NUMERO DE MICROORGANISMOS POR MILIMIETRO MEDIANTE LA FORMULA SIGUIENTE:

(FORMULA OMITIDA)

11.3. EXPRESAR LOS RESULTADOS CON DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS SOLAMENTE. PARA UN NUMERO DE TRES CIFRAS, REDONDEAR AL CERO MAS PROXIMO. SI LA TERCERA CIFRA ES 5, REDONDEAR A LA DECENA INFERIOR SI LAS DOS PRIMERAS CIFRAS FORMAN UN NUMERO PAR, Y A LA DECENA SUPERIOR SI LAS DOS PRIMERAS FORMAN UN NUMERO IMPAR. POR EJEMPLO:

234 230

235 240

225 220

245 240

11.4. SI SOLAMENTE HAY RECUENTOS INFERIORES A 10, INDICAR QUE DEL NUMERO DE MICROORGANISMOS POR MILILITRO ES INFERIOR A 10 X D; SIENDO "D" EL INVERSO DEL MAS BAJO FACTOR DE DILUCION.

11.5. SI HAY SOLAMENTE RECUENTOS SUPERIORES A 300, CALCULAR UN RECUENTO ESTIMADO A PARTIR DE LAS PLACAS QUE TENGAN UN NUMERO DE COLONIAS PROXIMO A 300 Y MULTIPLICARLO POR EL INVERSO DEL FACTOR DE DILUCION. REGISTRAR ESTE RESULTADO COMO "NUMERO ESTIMADO DE MICROORGANISMOS POR MILILITRO".

11.6. EL RESULTADO PUEDE EXPRESARSE EN UN NUMERO COMPRENDIDO ENTRE 1,0 Y 9,9 MULTIPLICADO POR 10 X; SIENDO "X" LA POTENCIA DE 10 APROPIADA.

12. REPETIBILIDAD

LA EXPERIENCIA ENSEÑA QUE SI EL RESULTADO MAS ALTO DE DOS ENSAYOS INDEPENDIENTES SOBRE LA MISMA MUESTRA SOBREPASA FRECUENTEMENTE EL RESULTADO MAS BAJO EN UN 30 POR 100, EL ANALISTA DEBE EXAMINAR SU PROCEDIMIENTO OPERATORIO PARA DETERMINAR SUS FUENTES DE ERROR.

13. INFORME DEL ANALISIS

EL INFORME DEL ANALISIS DEBE INDICAR EL METODO UITILIZADO, EL RESUTADO OBTENIDO Y SU FORMA DE EXPRESION. DEBE MENCIONAR TODOS LOS DETALLES NO PREVISTOS EN LA PRESENTE NORMA O LOS FACULTATIVOS, ASI COMO LOS INCIDENTES EVENTUALES SUSCEPTIBLES DE INFLUIR SOBRE LOS RESULTADOS.

EL INFORME DEBE PROPORCIONAR TODOS LOS DATOS NECESARIOS PARA LA COMPLETA IDENTIFICACION DE LA MUESTRA.

14. CORRESPONDENCIA

LA PRESENTE NORMA SE CORRESPONDE CON LA NORMA INTERNACIONAL FIL 100:1981 (PROVISIONAL).

ANEJO 4

RELACION DE EQUIPOS ANALIZADORES AUTOMATICOS

1. PARA LA DETERMINACION DE MATERIA GRASA

MILKO-TESTER MINOR; MILKO - TESTER MK II Y MILKO - TESTER MK III.

2. PARA DETERMINACION DE PROTEINAS

PRO - MILK MK II.

3. PARA DETERMINACION DE MATERIA GRASA, PROTEINAS Y OTROS COMPONENTES

INFRA ALYZER 400D; MILKO - SCAN SERIE 100; MILKO - SCAN SERIE 303; MILKO - SCAN SERIE 605; MULTIESPEC Y NEOTEC 7000.

4. PARA RECUENTOS MICROBIANOS

AMS 40-10; BACTOMETER M-123; BACTOMETRIC; BACTOSCAN; LUMAC BIO-COUNTER; MALTHUS SYSTEMS Y PETRI FOSS.